Hè a PCR hà da fà cù Sequencing in DNA è Gengi Ammuicanti
A riunione di a polimerase ( PCR ) hè una tecniche genetica molecculae per aduce parechji copie di un genu è hè ancu parte di u prucessu sequencing genicu.
Cume a polistunuta Chjassu di a Pulenda Polymerase?
E copi di Genie hè fatta cù una mostra di DNA, è a tecnulugia hè bona bè cumu parechji copie da una sola copia di u geniu truvatu in u sample. L'amplifikazzjoni di PCR di un gen per fà milioni di copie, permette a deteczione è l'identifikazzjoni di e sequenze di genesi utilizighjate tecniche visuale in basa di u grandore è a carrega (+ or -) di a pezza di DNA.
Cumu cuncorda cuntrullati, i picculi sindicati di DNA sò generati da enzimi cunnisciuti com'è DNA polymerase, chì aghjunghje deoxinucleotidi libri (dNTP) à un pezzu di DNA cunnisciutu com "mudellu". Ancu i pezzi più chjude di DNA, chjamati "primers" sò usati com puntitu di iniziale di a polimerase. Primi sò picculi piccatti di l'ADN (oligomeri), di solitu entre 15 è 30 nucleotidi longu. Hè fattu di sapè o guessing sequences dê DNA à l'estremità assai di u genu esse amplificata. Durante a PCR, u DNA hè secuvene hè cale è i doppia armatura siparanu. Finu à a rinfrescante, i primers s'ellevanu à u mudellu (chjamatu annealing) è creanu un locu per a polimerase per inizià.
A tecnulugia di PCR
A riunione di a polimerase (PCR) hè fatta pussibili da u scuperta di termòfili è di l'enzimi polifasei termofiliche (enzimi chì manteni a intricità strutturale è a funziunalità dopu à scaldate à a temperatura alta).
I passi in a tecnulugia di PCR sò dinò:
- A creazione hè creata, cun cuncettzioni ottimizzati di u mudellu di DNA, l'enzima di polimerase, primers è dNTP. A capacità di calà a misura senza desnaturalizà l'enzyme permette a desnaturalizazione di a doppia helix di a specie di DNA in temperatures in a serie di 94 gradi Celsius.
- Dopu a denaturazione, u mutage hè immersi in un rango più moderatu, circa 54 gradi, chì facilita l'annealing (binding) di i primi à i mudelli di DNA di stanca.
- In u terzu passu di u ciculu, u furmagliu hè scaldatu à 72 gradi, a temperatura ideale per Taq DNA Polymerase, per allungamentu. In l'allungamentu, l'ADN polimerase utilizate a chjave unica originale di l'ADN com un mudellu per aghjà dNTP di complementarii à i 3 i puntati di ogni coperta è generà una retazione di DNA di battuto in a regione di u genu d'interessu.
- Primi chì annealed à a sequenze di DNA chì ùn sò micca un match exactu ùn anu micca ristatu à 72 gradi, cusì limite l'allungamentu à u genu d'interessu.
Stu prucessu di desnaturalizazione, annealing e elongazione sò ripetuti multiple (30-40) volte, è cusì crescente in modu espunentiu u numaru di copie di u genu desitjatu in a mistura. Ancu s'è questu prucessu esse tostamente à esse realizatu manualmente, i mostri pò esse appruntate è incubati in un Thermocycler programmàvule, oghje cumune in a maiò parte di i laboratorii moleculari, è una reazione di PCR completa pò esse realizatu in 3-4 ore.
Ogni passu ddiatura ferma u processu d'allungamentu di u ciculu precedente, perde truncate a nova fila di DNA è a mantene à appruppendu a dimensione di u genu desitatu.
A durazione di u ciclu di ellu stessu pò esse più longu o curtaghja secondu a dimensione di u genu d'interesse, ma eventualmente, per cigliu ripetuti di a PCR, a maiuranza di mudelli serà ristretta à a dimensione di u genu d'interessu solu, cum'è saranu fatti di i prudutti di i primi.
Ci hè parechje diversi fatturi per a PCR rializatu chì pò esse manipulatu per rinfurzà i risultati. U metu più amplamente utilizatu per pruvà per a prisenza di u prugramma PCR hè l'elettroforesi gel à agarose . Chì s'aprizza à separà i fragmenti di DNA in basa di u tagliu è u caricu. I fragmenti sò visualizati cù tingli o radioisistopuli.
L 'evoluzione
Dopu à a scuperta di PCR, l'ADN polimerasiati altri chì l'Taq originale sò stati scuperte. Arcuni di questi anu una capacità "correlativa" di più o sò più stabili à e temperate superiore, cusì à migliurà l'specifichi di PCR è reducennu i errori di l'inserzione di u dNTP incorrecte.
Arcuni variazioni di a PCR sò stati discu di appiicazioni specifici è sò oghji usatu regularmente in laboratori genetico moléculaire. Arcuni di questi sò PCR di Realtà è PCR di Reverse Transcriptase. U scuperta di a PCR hà ancu guverntu per u sviluppu di a sequencing di DNA, di l'impresa di l'ADN è di altre tecniche molecular.