Aghjustamenti à qualsiasi cumpunenti di a Reazione di a Reaczione Chaintera di Polymerase (PCR) pò cambià a qualità di u risultatu, o migliurà o diminuì u pruduttu di produttu è a qualità o à migliurà a spezialità di reazione è a sensibiliità. Parametri chì influenzanu u risultatu finali pò esse fìsicu (per esempiu, a temperatura, u ciclo di tempu) o quimici (ie, cuncentrazione di mudellu, tipu di enzimi utilizati). I seguenti sò parechji fatturi clau chì influenzanu u successu di a PCR.
01 Prutizzioni di u Laboratoriu Nilu
Perchè PCR hè capaci di detta una sola molecule di DNA, hè impurtante per mantene e pristine conditions in u laboratoriu. Sempre tenu guanti freschi, uttene un insemi sterile, cunsiste è pipette è cunsiglii di sterile, è pulite l'attività di travagliu prima di travaglià.
Sempre include ripertazione di cuntrollu, senza DNA di mudellu è senza enzyme, per assicurà e risultati sò veramente a causa di l'amplifikazzjoni di u dispusitivu.
A maiò parte di a ghjente stà sicuru d'avè u so propiu settellu di suluzione chì ùn sò micca spartuti per fà e stuzzichini più fàciule è i pipettes designati sò spessu destinati per a PCR solu. DNase è RNase-free PCR tubes, cunsiglii di pipette aerosol resistente è di travaglià in un capriccio di fume con u luminosu UV sò ancu modi per minimizà i prublemi.
02 Componenti chimichi
- Hannu 18 a 24 base
- Ùn sò micca struttura secundaria (ie, hairpin loops)
- Hè distribuzione equilibrada di G / C è A / T parenti
- Ùn sò cumplementarii l'una di l'altri à i 3 minuti
- Temperate da funnamentu (Tm) circa 5-10 gradi Celcius sottu à a temperatura ambientali, chì hè spessu entre 55 è 65 gradi Célusus
U Tm per i primi primirsi anu ancu esse simile à i megliu risultati.
03 Reazione Mix: Template è Primi
Optimal primer concentrations sò entre 0.1 è 0.6 micromoles / L. A quantità di mudellu varia cù u tipu di DNA (umanu, bacterial, plasmid).
Cù quantità di chjave di mudellu, ci sò altre stratezii per migliurà risultati, cum'è numeali di cicle di aumentu o l'usu di "prima cuminciari". Pruvate sempre cume primi primi cun una reazione di cuntrollu pusitivu, per assicuratevi chì travaglià in vostri cundizioni esperimenti esperimenti.
04 Reazione Mix: Enzyme Attività
A cuncintrazioni di MgCl2 in a mixtura di a reaczione pò influene u risultatu di PCR è puderia ghjucà un rolu impurtante in reesioni più fastidiosi. U catione di magnesiu sò formae di cumplicezzii solubuli cù dNTP per pruduce a sustrato propriu chì l'enzima di a polimerase ricunnosce.
E quantità nant'à i quattru dNTP anu ancu aiutu à reduciru a taxa d'errore di a polimerase. Certi additivi, such as betaine, BSA, detergenti, DMSO, glicerol, è pirofosfatasa pò ancu ancu influene a specificità di l'enzyme o l'effizione di a riazione.
05 Tipu di Thermocycler
Quandu shopping per u laboratoriu di furmagliu, tenite in mente chì alcuni termociclaghji sò menu precisus chì altri à mantene e preziosse, i temperati desitati.
Questu hè un spaziu chì viaghjanu bonu ùn devenu micca pagà in a longa volta quandu si face sott'à una reazione finicky o uttene primers chì necessite un vechju sturitu di temperature annealing.
Tubi di reazione di morsa fugliale disinniati per sceglie a marca precisa di termocicloer chì utilizate, aiuta ancu aiutà ottimisizzioni di e temperature.
06 Centrazione
U risurtatu enorminu pò esse ottu incù l'aumentu di l'allargamentu annantu à ognunu di 20 cicli, per cumpensà a so enzima per amplifying more template. Normalmente, menu di 40 cicli hè abbastanza per amplifying menu di 10 molécule mudelli à una cuncintrazione grande abbastanza per vedà nantu à un gelato agitose stante di bromurese d'ethidium.