A sequencing di DNA hè ancu dipendente di a nostra abilità di utilizà l'elettroforesi gelatinosa à fegate di filusufìa di DNA chì si distenu in grandezza da quì pocu cum'è un par base.
DNA Sequencing
À a fini di u 1970, dui tecniche di sequencing di DNA per e molèuli di DNA più longu sò stati inventati. Eccu u metudu Sanger (o diodeoxi) è u metale di Maxam-Gilbert (scatula chimica). U methile di Maxam-Gilbert hè basatu annantu à a splutazioni nucleari è spicifizzioni specifichi per i chimichi è hè megliu utilizatu per sequenza d'oligonucleotidi (polímmi nucleosidi puri, nurmalmentu più chjucu di 50 parabolte in lonxitude). U metudu Sanger hè più cumunemente utilizatu perchè hè statu pruvatu tecnicamenti facilmente d'applicà, è, cù l' avventu di a PCR è l'automatizazione di a tecnica, hè facilmente aplicatu à i filamenti longi di DNA, cumprendi parechji geni sani. Sta tècnica hè basatu annantu à a catene di terminazione per i didesossinucleotidi durante a retazioni di elongazione di PCR.
Sanger Method
In u metudu Sanger, a fila di DNA per analizà si hè usata cum'è un mudellu è a DNA polimerase se usa, in una reazione di PCR, per genere filamenti complimentari using primers.
Quattru temi di riposu di a retazioni di PCR sò preparati, chì chjavi coseu un certu percentinu di l'analogi di trifosfat dideoxi-nucleosidi (ddNTP) à unu di i quatre nucleòtidi (ATP, CTP, GTP o TTP). Sinuvisione di a nova fila di DNA si cuntinueghja finu à chì unu d'sti l'analogi sò incorporati, à quale tempu u filu hè chjucatu prematura.
Ogni ricerca di PCR finiscinu quandu cuntene una mezchemu di distanzi diffirenti di i filamenti di DNA, tutti finisci cù u nucleòtitu chì era dideoxi etiquetada per una reazione. L' elettroforesi Gel hè aduprata à separà i filamenti di e quatru reazzione, in quattru viaghji distinti, è stabilisce a sezione di u mudellu originale nantu à quali longhi di i filamenti finiscinu cu quellu nucleotide.
In a Reazione automatica Sanger, i primers sò utilizati chì sò tichittati da quattru culore distintivo tag fluorescente. Reaczioni di PCR, in a presenza di i nuclérodeidi differenti di dideoxi, sò realizati cumu se l'anu detta. Inoltre, dopu, i quattru mixturesi di retazioni sò cumbati è appiicati à una sola linea di gel. U culore di ogni fragilamentu si detecta cù un raghju laser è l'infurmazioni hè colauta da un computer chì genera cromatogrami chì mostra cimini per ogni culore, da quale a schema di DNA pò esse determinata.
Di genere, u metu di securizazione automatizatu hè solu accurate per sequenzi à un massimu di circa 700-800 base-pairs in longitude. In ogni modu, hè pussibile ottene sette sequenza di genesi maiori è, in particulare, genomi sani, uttene prudutti mudificà, cum'è Prime Walking e Shotgun sequencing.
In Primu Mancu , una parte viaghja di un genu più grande hè seccenu cù u metu Sanger. I primi primi sò generati da un segmentu affidante di a secùnea è utilizate à continuà a secunizazione di a parte di u genu chì era fora di l'aghjunghje di e reazzioni originali.
A securizazione scopula hè stata attraente di chjappà u segmentu di l'interessu di DNA in fragments di più appropritatu (gestibile) di sizzioni, sequencing cada fragmentu è arregistramentu e pezzi base in secuenze overlapping. A so tecnica hè stata facilitata da l'applicazione di u prugramitariu di l'infurmazione per preparalli e muntagnuli.