U gradu di purità di a prucessu necessariu deprezza di u usu finali di a prutetta.
Per quelli appricazzioni, un estru crudu hè abbastanza. In ogni modu, per altri usu, cum'è in l'alimentari è farma pruduttu, hè necessariu un livellu di purità. Per ghjunghje quì parechji pruduzzioni di purificazione di prutezzione sò spissu usati, in una serie di purificazione.
Ogni passu di purificazione di a purificazione sò generalmente risultati di qualchì diploma di perdita di produzzione Per quessa, una struttura di purificazione di prutezione ideale hè quella chì invece u livellu più altu di purificazione hè in quattru passi. A selezzione di i passi à l'usu hè dipenditu da a dimensione, a cundizione, a suluzione è altre proprietà di a proteina di destinazione. I tecnichi seguenti sò più appruvati per purificà una sola citosolica. A purificazione di i complexi di a citosolica di a proteina hè più complicata è dettesente esse dumandata esse applicati diversi mètudi.
Primi passi per a purificazione di prutezione
U primu passu à a purificazione di u cellu intracellular (à a cella) hè a preparazione di un extracte crudo .
U siltuu cuntene una cumpreta mutazione di tutte e prutrate da u citoplasma cellulana, è parechji macromoleculi supplementari, cofacturi è nutrienti. L'estru crudu pò esse usatu per parechje appiechi in biotecnologica, in casu chì a purità hè un prublema, i passaggi sussurdinati di purificazione deve esse segui.
L'estratti di prutezione di prutezione sò preparati da eliminazione di scumuli cellulari generati da lisi celula, chì hè stata uttinutu chimichi è enzimi , sonicazione o un Presse Francese. U riti hè eliminatu da a centrifugazione, è u supernativu hè ricuperu. Preparati crui di prutini straniuli pò esse acquistatu solu da eliminà e cilesti per centrifugazione.
Per certi apprictamenti biotecnologichi , ci hè una dumanda di enzimi termoestable : Enzimi chì ponu tollerà altitudini ghjunghimi senza u denaturità, è ancu mantendu una alta attività specìfica. L'urganismi chì anu produttori sò eventualmente chjamati extremophiles. Un accortaggiu facilitu à purificà una proteina resistente à calor hè di denatura di l'altri protei in a mezora da u calduzzu, appena rinfriscà a suluzione (permette chì l'enzima termostabile riforme o redissolve, in casu di necessariu). A proteins denaturazione pò esse eliminata da a centrifugazione.
Pasti di purificazione intermediata
In u passatu, un secondu passaghju cumuni à purificà una proteina da un scuru crudu hè da a precipitazione in una solu cun forza alta intossibule (solu solu di sal). L'acidus nuclei in u estru crudu pò esse sbulitatu da l'agrumogere precipitanti furmati cù sulphate streptomicina o protaminu sulphate.
A precipitazione di prutezione hè generalizata cù u sulfatu ammoniu cum'è u salitu.
Diversi prutini macerate in diverse concentrazioni di sulfate ammoniu . In generale, e prutezione di pesu moleculare più altu precipitate in concentrazioni più minimu di sulfatu ammoniu. A precipitazione di u salu ùn sianu micca purtatu à una pruduzione altamente purificatu, ma pò assicurà l'eliminazione di qualchì prufette indettendu in una mistura è cuncentra a mostra. I salti in a suluzione sò rimoti da a dijalisi per u cuttulamentu poru di celulosa, a filtrazzioni o a cromatografia di l'exclusionu di u gelu.
I protokolli di biotecnologi muderni spessu si prufitti di i parechji kittie cummercializate chì furnisce solu solu solu per i prucessi standard. A purificazione di prutezione hè spessu realizata usando filtri è e preparazione di filtri di gel di filtrazione. Tuttu ciò chì hai da fà hè seguitate e struzzioni è aghjunghje u volumu correctu di a suluzione giusta è esperendu a durata durata di tempu mentre cullittendu l'eluant (chì vene fora l'altru finale di a colonna) in un novu tubu di teste.
- I metudi cromatoggichi ponu esse applicati cù i culleghji bench-top o l'equipaggiu automatizatu HPLC. Hippocampe di HPLC pò esse fatti da mette in reverse-phase, scambio d'iò, o metudi di dimustrazzioni di dimenisuni, è e lagune detecciate per tecnulugia di laser di scatula o di laser. El
Vicularizazione di Proteini è Avalazzioni di Purificazione
- A cromatografia di rifinisce (RPC) separa prutezioni basati in i so idrofobizite relattivi. A so tecnica hè assai selectiva ma es necessariu l'utilizzu di dissolventi organici. Certi cocchi proteini sò sempre denatured da solu dissolvuti è perderà a funziunalità durante a RPC. Perchè stu metu ùn hè micca ricunnisciutu per tutti l'applicazioni, particularmente se hè necessariu di a proteina di destinazione à mantene l'attività.
- A cromatografia di iambulacciu si riferisce à a separazione di i prutezioni basati nantu à a tarifa . I colunità puderanu esse preparatu per un scambiu d'una anione o un cationscation exchange. I coloni di scambiu d'annunziu cuntenenu una fase fissaria cun una cundutta positiva chì attrae proteins imprecisu. I cungondi di a cambia di cation sò i reverse, bànies à negativament carricati chì prununzate i protezii pusitivamenti carcu. Elution of the target protein (s) hè fattu per cambià u pH in a colonna, chì risultatu in un cambiamentu o neutralizazione di i gruppi funziunali imposti di ogni proteina.
- Cromatografia di dimenzje di dimenzja ( filtrazione di gel ) separa proteini più grande di i chjuchi, postu chì a molécula più grande viaghja più veloce da u polimeru reticulatariu in a chromatographie. I grande e pruteanu ùn si sò micca incunate in i pori di u polmeru, mentre chì i proteins più chjucu, è ripiglianu più per viaghjà in a colonna di cromatografia, via a so rotula diretta. L'Eluate hè recullatu in una serie di tubi chì separanu a prutezzione basatu à u tempu d'elució. A filtrazione di gel è un uttellu utili per a cuncentrazione di una mostra di prutezione cum'è chì a proteina di destinazione hè recullata in un volume di elución più chjuca di l'iniziatu à a colonna. Tali tecniche di filtrazzioni pò esse usatu durante a produzzione di proteina a grande escala per causa di a so costeffettitudine.
- A cromatografia d'affinità hè una tecnica assai utile per "lustraru" o cumplettendu u prucessu di purificazione di a purificazione. U Beads in a cromatografia di a cullette sò interspondenziati cù ligandini chì liganu specifiche à a proteini di destinazione. A proteina hè rimintata da a cullezione cù l'ac acculturà cù una suluzione chì cuntene ligande libretti. Stu metuu dà i risultati i più purti è l'attività più alta specìfica nantu à e altre tecniche.
- L'SDS-PAGE hè l'electroforesi di u poliacrilamida, realizata in a prisenza di SDS (sodium dodecyl sulfate) chì attacca à i proteini chì dà una gran retazione negativa negativa. Siccome chì i carichi di tutte e pruteanu sò assai ugguali, stu mètudu separanu quasi sanu sanu sanu à grandezza. A SDS-PAGE hè spessu usata per pruvà a purità di a proteina dopu ogni passu in una serie. Comu a prutezione pocu distanza da a mutazione, a quantità di bandi visualizati nantu à u gel di SDS-PAGE hè ridutta, finu à chì questà solu una banda chì rapprisenta a proteziosa chì vole.
- Immunoblotting hè una tecnulugia di visualizazione di a proteina applicata in cunglisazione cù a cromatografia d'affinità. L'estatura per una spetacula proteini sò usati cum'è ligami nantu à una culunia di cromatografia d'affinità. A protezione di destinazione hè stata mantinuta nantu à a colonna, da sminisfatta cù l'aciculate a colonna cù una solu salentina o altre agent. I servizii di l'anticheghjei cunnessi à l'aiutu di u magneticu radioattivu o di u dissimulatore aiuta in a deteczione di a proteina di destinazione una volta hè siparata da u restu di a mistura.
Sources:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protezione Purificazione Manuale, Edizione AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.